New concept for the development of anti-toxin substances based on aptamer technology : the establishment of a model system

Syftet med studien var att utveckla ett system för selektion av specifika neurotoxininhibitorer. Charybdotoxin (CTX) användes som modelltoxin. Arbetskonceptet bestod av två delar, etablering av ett in vitro-modellsystem för analys av toxin-målmolekyl interaktioner samt utveckling av ett selektionssystem av inhiberande substanser. Studien beskriver utvecklingen av ett modellsystem för att mäta interaktionen mellan CTX och dess målmolekyl i form av endera renade kanalproteiner eller kanalproteiner integrerade i cellmembraner. Två rekombinanta kanalproteiner konstruerades i det prokaryota KcsA kanalproteinet. Ett testsystem, en effluxassay som utnyttjar en rekombinant cellinje som uttrycker Kv1.3 kanalproteinet, vilket reflekterar CTXs interaktion med membranintegrerade eukaryotiska K+ kanaler, sattes upp. Rubidium effluxassayn visades vara användbar för analys av CTXs inhibitoriska effekt. Ett protokoll för selektion av potenta toxininhiberande molekyler, aptamerer, beskrivs också i den här studien. Aptamererna besitter hög specificitet och affinitet för sin målmolekyl och har egenskaper som gör dem användbara för olika typer av applikationer. Oligonukleotidbiblioteket som konstruerades för den här studien består av en slumpmässig sekvens på 60 nukleotider omgiven av definierade regioner. Detta bibliotek utgjorde en bra grund för framgångsrik selektion av CTX-bindande aptamerer. En modifierad SELEX-metod för storskalig selektion av aptamerer sattes upp och optimerades. Den visade sig vara användbar för att uppnå önskat resultat.